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應(yīng)用指南

BiacoreTM系統(tǒng)幵展免疫原性檢測(cè)

介紹

免疫原性是指生物藥物被注射到病人體內(nèi)引起不必要的 免疫應(yīng)答的藥物屬性。由于影響藥物的安全性和有效性, 當(dāng)幵發(fā)新型蛋白藥物時(shí)，免疫原性是必須考慮的重要方 面。免疫原性測(cè)試需要在臨床前和臨床階段進(jìn)行。 美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的《工業(yè)指南：治療性蛋白免 疫原性測(cè)試的方法幵發(fā)》⑴列明：免疫原性檢測(cè)方法 除靈敏度要求外，還必須能夠檢測(cè)所有抗體亞型，特別 是IgM和IgG亞型。推薦的靈敏度是250到500ng/ml。免 疫原性分析包括三個(gè)步驟：陽(yáng)性藥物的篩選、驗(yàn)證和表 征。初步篩選中可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，因此，在初步 篩選后通常需要進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)對(duì)陽(yáng)性樣品的鑒定和驗(yàn) 證后，就可以對(duì)初篩結(jié)果中的抗藥抗體(Anti-Drug Antibodies, ADAs)幵展全面的研究，包括其亞型(類(lèi)或 亞類(lèi))分析、結(jié)合穩(wěn)定性、抗原表位特異性和中和能力， 這些數(shù)據(jù)為深入研究免疫應(yīng)答提供了寶貴信息。
 

Aarden等人(2)觀察到IgG4是僅次于IgGl的由治療性單克 隆抗體(MAbs)產(chǎn)生的ADAs的主要亞型°IgG4—直與 治療性蛋白藥物的高劑量注射和長(zhǎng)時(shí)間暴露下所產(chǎn)生的 免疫應(yīng)答有關(guān)。由于IgG4型ADAs具有雙特異性(bi-specific nature)，因此，其很難通過(guò)傳統(tǒng)的橋聯(lián)或均一的酶聯(lián)免 疫吸附法(ELISA)和增強(qiáng)性化學(xué)發(fā)光(ECLTM)方法檢測(cè)。 GE Healthcare提供了設(shè)計(jì)符合免疫原性分析流程通常所 要求的，符合GLP/GMP管理規(guī)范的系統(tǒng)。本文中的實(shí)例 展示了非標(biāo)記生物物理互作分析方法是如何成功地應(yīng)用 于免疫原性研究流程的所有環(huán)節(jié)，并確保免疫應(yīng)答的高 可信度檢測(cè)、驗(yàn)證和全面表征的(圖1)。同時(shí)，本文也 對(duì)Biacore系統(tǒng)和表面等離子體共振(SPR)技術(shù)的優(yōu)勢(shì) 與傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行了比較。

圖1.—個(gè)典型的用于免疫原性分析的多步流程，包括篩選以發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品、陽(yáng)性樣品的驗(yàn)證以及對(duì)確認(rèn)的陽(yáng)性樣品 的進(jìn)一步表征。測(cè)試范圍根據(jù)法規(guī)、藥物類(lèi)型和臨床前/臨床階段的不同要求而不同°Biacore系統(tǒng)在整個(gè)工作流程中 提供了寶貴的信息。
 

公認(rèn)的靈敏度及對(duì)咼、低親和度抗藥抗 體的檢測(cè)—種經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的，基于Biacore 3000系統(tǒng)構(gòu)建的，針對(duì) darbepoetin alfa 和epoetin alfa 的ADAs 篩選方法的檢測(cè) 靈敏度分別可以達(dá)到100ng/ml和80ng/ml（3）。另一個(gè)研 究報(bào)道稱(chēng)，Biacore對(duì)romiplostim和促血小板凝集素的 ADAs的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到400ng/ml和200ng/ml。除 了達(dá)到法規(guī)要求的靈敏度外，Biacore系統(tǒng)還提供了寶貴 的動(dòng)力學(xué)信息，并同時(shí)能夠檢測(cè)高、低親和度的抗藥抗體。

在下面的例子中，勃林格殷格翰公司（Boehringer Ingelheim）在對(duì)治療用人源化抗體在臨床I期多劑量研 究中比較了Biacore檢測(cè)法和橋聯(lián)ELISA檢測(cè)法。結(jié)果顯示，Biacore T1001檢測(cè)法相比ELISA檢測(cè)法可以更早地 發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品（圖2）。這些早期免疫應(yīng)答的ADAs抗 體通常具有低親和度，且具有快結(jié)合/快解離的動(dòng)力學(xué) 特征。盡管ELISA檢測(cè)法的靈敏度相對(duì)較高，但由于考 慮到需同時(shí)對(duì)早期和成熟期的免疫應(yīng)答都做出檢測(cè)的重要性，Boehringer Ingelheim 最終選擇了 Biacore 檢測(cè)法作為他們免疫原性的篩選手段。

圖2.優(yōu)化的Biacore検測(cè)法在第一次注射（藍(lán)色柱）兩到三周后便能検測(cè) 到“持久性”和“過(guò)渡性”的免疫應(yīng)答，而橋聯(lián)ELISA検測(cè)法只能在注 射后12周后的“持續(xù)性”免疫應(yīng)答階段做出検測(cè)，但是“過(guò)渡性”的免 疫應(yīng)答階段根本無(wú)法検測(cè)。

Biacore檢測(cè)法可以檢測(cè)低親和度ADAs的優(yōu)勢(shì)也被Lofgren 等所證實(shí)⑸。他們比較了橋聯(lián)ELISA方法與Biacore 方法對(duì)于全人源panitumumab（ 一種與EGF受體結(jié)合的 單克隆抗體）的免疫原性分析°ELISA檢測(cè)法對(duì)高親和 度的ADAs檢測(cè)更加靈敏，但是Biacore檢測(cè)法對(duì)于低親 和度ADAs的檢測(cè)相比而言卻靈敏得多。對(duì)于來(lái)自臨床 試驗(yàn)的樣品，Biacore檢測(cè)法比ELISA檢測(cè)法可以檢測(cè)到 更多的陽(yáng)性樣品。此外，Biacore方法還利用中和抗體 （Neutralizing Antibodies, NAbs）發(fā)現(xiàn)了8種陽(yáng)性樣品, 而這些樣品在用ELISA方法檢測(cè)時(shí)卻被遺漏了。
 

大量關(guān)于應(yīng)用橋聯(lián)ELISA檢測(cè)法和Biacore免疫原性檢測(cè) 法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果的比較總結(jié)于表1。在所有的 情況下，Biacore方法能夠比ELISA方法檢測(cè)到更多的陽(yáng) 性樣品。一個(gè)可能的原因是由于使用Biacore檢測(cè)法可 以檢測(cè)到那些低親和度且快速解離的ADAs和IgG4 （見(jiàn) 下文）。

Swanson等人展示了那些在Biacore方法中可以檢測(cè)到 而在ELISA方法遺漏的ADAs的臨床意義（6）。來(lái)自8個(gè) 患有抗體（Ab）介導(dǎo)的純紅細(xì)胞障礙性貧血病人的樣 品通過(guò)Biacore方法檢測(cè)為陽(yáng)性，但其中兩個(gè)樣品在ELISA 方法中的檢測(cè)結(jié)果卻為陰性。

表1.利用ELISA和Biacore檢測(cè)法檢測(cè)的ADA陽(yáng)性臨床樣品

*在2011年慕尼黑生物制品免疫原性會(huì)議上展示的酸解離檢測(cè)法

+其中一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在基于細(xì)胞的檢測(cè)法中具有中和效果

:其中八個(gè)被發(fā)現(xiàn)在基于細(xì)胞的檢測(cè)法中具有中和效果

§所有八個(gè)樣品都來(lái)自具有抗體介導(dǎo)的純紅細(xì)胞障礙性貧血病人

Nechansky等人也觀察到Biacore方法可以檢測(cè)到顯然更 多的ADA樣品數(shù)（8）,并得出結(jié)論-表面等離子共振技 術(shù)（SPR）是首選方法，這主要是由于Biacore能夠檢測(cè) 低親和度的ADAs，同時(shí)提供定量數(shù)據(jù)，例如結(jié)合和解離 速率以及亞型的鑒別。

對(duì)ADAs抗體的自動(dòng)帶藥篩選

藥物干擾對(duì)于所有免疫原性檢測(cè)法都是一個(gè)棘手的挑戰(zhàn), 特別是那些用于治療性單克隆抗體，藥物經(jīng)常以相當(dāng)高 的劑量給藥，并擁有較長(zhǎng)的半衰期。樣品中所存在的藥 物能夠結(jié)合ADAs，并阻止ADA與偶聯(lián)（包被）在芯片上 的藥物分子結(jié)合，因此會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。Biacore T200 系統(tǒng)通過(guò)自動(dòng)酸化解決了這個(gè)問(wèn)題，它能夠在存在過(guò)量 藥物的環(huán)境下對(duì)ADAs進(jìn)行檢測(cè)。樣品通過(guò)酸化，使得藥 物-ADA復(fù)合物解離，然后在測(cè)定即將幵始前被中和，從 而避免重新形成藥物-ADA復(fù)合物。自動(dòng)酸化的優(yōu)點(diǎn)是樣 品只需要被短暫酸化，且對(duì)于所有樣品酸化時(shí)間都是固 定的。

這種酸解離策略使得Biacore檢測(cè)方法在藥物存在時(shí)也能 夠達(dá)到推薦的靈敏度。例如，不同濃度的抗rituximab抗 體與濃度逐級(jí)增加的藥物（rituximab）混合。在存在100 倍過(guò)量（摩爾比）的rituximab的情況下檢測(cè)到有0.5 g/ml 的抗rituximab抗體（圖3）。

圖3.使用（紅色）或不使用（藍(lán)色）酸解離策略在存在不同濃 度rituximab下對(duì)0.5 n g/ml的抗rituximab抗體的檢測(cè)。

英國(guó)伯明翰大學(xué)的一個(gè)研究小組分析了來(lái)自SLE病人的臨 床樣品中抗rituxima b抗體和rituxima b的水平⑼。在裝有免 疫原性模塊的Biacore T100儀器中采用酸解離操作發(fā)現(xiàn)了 樣品中以前被rituximab所掩蓋抗rituximab抗體。酸化分析 也顯示樣品中rituximab的存在，而不采用酸化則不能檢出 其存在。在2011年慕尼黑生物制品免疫原性會(huì)議上，來(lái)自 Merck Serono的Kramer博士展示了采用酸解離方法的自動(dòng) 化Biacore檢測(cè)法的結(jié)果，并與基于ELISA的酸解離檢測(cè)法 進(jìn)行比較。當(dāng)將69個(gè)臨床樣品進(jìn)行比較時(shí)，相同的陽(yáng)性 樣品在兩種檢測(cè)法中都被檢出（部分結(jié)果被顯示在圖4中）。 然而，Biacore T100檢測(cè)法卻發(fā)現(xiàn)更多的陽(yáng)性樣品，對(duì)于 這種行為的可能的解釋是Biacore檢測(cè)法也可以發(fā)現(xiàn)那些具 有低親和度的ADAs,因?yàn)樗鼈兛赡茉贓LISA的洗滌步驟被 洗掉。

Merck Serono發(fā)現(xiàn)Biacore T100檢測(cè)法可以實(shí)現(xiàn)卓有價(jià)值 的自動(dòng)化運(yùn)行，節(jié)省勞動(dòng)力成本和降低出錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)。這在 檢測(cè)方法被轉(zhuǎn)移到CRO公司時(shí)凸顯巨大的優(yōu)勢(shì)。相比而言， ELISA檢測(cè)法的步驟較為繁瑣，包括多步手動(dòng)移液操作， 并且一般需要三天左右才能獲得結(jié)果。

 ELISA工作流程
 

Biacore工作流程

Biacore T100檢測(cè)法可以將樣品的制備工作量降至最低。 與ELISA檢測(cè)法相比，很少的手動(dòng)操作為Biacore檢測(cè)法 提供了更高的精確度（表2）。

圖5Biacore和ELISA免疫原性檢測(cè)法工作流程

Kramer博士認(rèn)為，“Biacore看起來(lái)是一種應(yīng)用酸解離檢 測(cè)法的理想技術(shù)”，Merck Serono正在多個(gè)項(xiàng)目中使 用Biacore系統(tǒng)幵展基于酸解離的免疫原性篩選檢測(cè)法。 表2.具有酸解離的檢測(cè)法批次間精確度比較。數(shù)據(jù)由 Merck Serono友情提供

ELISA，百分比偏差 Biacore， 百分比履

圖4.病人臨床樣品中ADAs的檢測(cè)。

大分子應(yīng)用專(zhuān)題

通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)去除假陽(yáng)性結(jié)果

藥物競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法通常被用于驗(yàn)證陽(yáng)性響應(yīng)是由于ADAs 特異結(jié)合于藥物，而不是與其他血清組分的相互作用。 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)很容易在Biacore系統(tǒng)上進(jìn)行；添加過(guò)量的藥 物到樣品中從而抑制結(jié)合響應(yīng)值，以證明響應(yīng)是來(lái)自 ADAs與傳感器表面上的藥物之間的特異結(jié)合（圖6）。 整個(gè)程序可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

 

圖6使用Biacore系統(tǒng)的驗(yàn)證分析。

對(duì)ADAs的綜合表征
 

在陽(yáng)性樣品的鑒定和驗(yàn)證后，可以使用Biacore分析進(jìn)行 全面的表征。競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合分析、亞型分析（種類(lèi)或 亞型）、結(jié)合穩(wěn)定性、抗原表位特異性和中和能力研究 都為全面認(rèn)識(shí)免疫應(yīng)答的性質(zhì)提供寶貴信息。Biacore T200提供專(zhuān)門(mén)的軟件工具模塊用于亞型分析和結(jié)合穩(wěn)定 性測(cè)試。
 

ADAs的亞型分析
 

ADAs的亞型分析提供了關(guān)于ADAs的免疫功能的信息，例 如抗體Fc受體結(jié)合。亞型分析流程如圖7所示。在Mytych 等的研究中，含有抗darbepoetin alfa的血清ADAs的12個(gè) 臨床樣品被用于幵展亞型分析⑶。所有樣品均分別對(duì) 應(yīng)某種特定的抗體亞型，四個(gè)主要的抗體亞型都被檢測(cè) 出來(lái)。大多數(shù)ADA陽(yáng)性樣品含有IgG和IgM類(lèi)型。此外, 還發(fā)現(xiàn)了三個(gè)樣品呈現(xiàn)IgA陽(yáng)性，一個(gè)樣品呈現(xiàn)IgE陽(yáng)性。

圖7.利用Biacore對(duì)亞型進(jìn)行分析。來(lái)自樣品的ADAs可以與固定在表面 的藥物結(jié)合。然后，一系列抗亞型的抗體流過(guò)已結(jié)合上去的ADA，產(chǎn) 生響應(yīng)則表示存在不同的亞型。在這個(gè)圖中，抗igG2b試劑提供明顯 的響應(yīng)，鑒定出所結(jié)合的抗體為lgG2b亞型。

IgG4的檢測(cè)
 

正如美國(guó)食品和藥物監(jiān)督管理局（FDA）所要求的，免 疫原性檢測(cè)法應(yīng)該能夠檢測(cè)所有的IgG亞型（i）°IgG4 是治療性單克隆抗體的主要的一種ADAS亞型（2,6），部 分I gG4可以通過(guò)抗體間的隨機(jī)交換重組，造成抗體雙特 異性（圖8A）。雙特異性的ADAs在橋聯(lián)或同源檢測(cè)方式 法中無(wú)法檢出（圖8B），因而很難通過(guò)常見(jiàn)的ELISA或ECL 方法檢測(cè)的到。然而，IgG4在Biacore系統(tǒng)的直接結(jié)合模 式中可以被檢測(cè)到。

圖8.雙特異性ADAs在橋聯(lián)ELISA檢測(cè)法中不能被檢測(cè)到°（A）在人抗 體之間自發(fā)和隨機(jī)地發(fā)生交換，造成其中一些具有雙特異性。（B） 雙特異性IgG4在橋接ELISA中將不會(huì)被檢測(cè)，因?yàn)樗鼈儽仨氂袃煞N藥物 分子與一個(gè)ADA的結(jié)合。

抗原表位特異性的測(cè)定
 

在研究免疫原性時(shí)，ADAs的抗原表位特異性的測(cè)定十分 重要。根據(jù)FDA的建議（1）,申請(qǐng)人應(yīng)該研究在抗原上 的哪些區(qū)域產(chǎn)生了免疫應(yīng)答：“FDA建議申請(qǐng)人直接針 對(duì)完整分子和內(nèi)源對(duì)應(yīng)物進(jìn)行初步篩選試驗(yàn)。然而，對(duì) 于產(chǎn)品幵發(fā)，申請(qǐng)人應(yīng)該研究導(dǎo)致免疫響應(yīng)產(chǎn)生的特異 抗原區(qū)域或“抗原表位”。這種測(cè)定方法對(duì)于融合分子 可能尤為重要，因?yàn)閮蓚€(gè)蛋白是通過(guò)基因或物理手段被 “融合”在一起的?？梢栽诤Y選階段就利用Biacore系統(tǒng) 進(jìn)行抗原表位特異性的測(cè)定。一個(gè)便捷的方法就是固定 全長(zhǎng)的藥物在一個(gè)流動(dòng)池（Flow cell）中，同時(shí)固定藥 物的不同結(jié)構(gòu)域在其他流動(dòng)池中（圖9）。

圖9.同時(shí)進(jìn)行抗原表位作圖和亞型分析的檢測(cè)方法。
 

交叉反應(yīng)也可以采用相同的模式進(jìn)行測(cè)定，但是在每個(gè) 流動(dòng)池中固定不同的藥物。為了評(píng)估抗darbepoetin alfa 抗體是否存在潛在的對(duì)epoetin alfa的交叉反應(yīng)，Mytych 等幵發(fā)了一種基于Biacore的雙流動(dòng)池生物傳感器免疫檢 測(cè)法，其中含有一個(gè)固定有epoetin alfa通道（3）。這 種免疫檢測(cè)法被Amgen公司作為首選方法，用于檢測(cè)和 表征人血清中的抗epoetinalfa和抗darbepoetin alfa抗體。
 

Stubenrauch等人幵展的工作證明，可以通過(guò)很少量的 Biacore實(shí)驗(yàn)中獲取豐富的信息（10）。通過(guò)高效地利用 這四個(gè)流動(dòng)池，可以對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行整合11種指標(biāo)的完 整的的免疫原性檢測(cè)，包括臨床樣品中ADAs的應(yīng)答、亞 型、特異性和結(jié)合穩(wěn)定性等信息（圖9）。這種方法可將 來(lái)自藥物的特異性應(yīng)答與其他應(yīng)答區(qū)分幵來(lái)，例如抗Fc 片段的IgM類(lèi)風(fēng)濕性因子應(yīng)答。研究者可以跟蹤特定的 ADA形成的時(shí)間進(jìn)程，可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)每個(gè)病人的ADA應(yīng) 答分析，并與臨床觀察相關(guān)聯(lián)。評(píng)估ADA結(jié)合穩(wěn)定性一 般來(lái)說(shuō)，在生物分子相互作用實(shí)驗(yàn)中，解離速率是一種 可以估計(jì)結(jié)合親和度的指標(biāo)，抗體朝著更高親和度方向 上成熟通常會(huì)反映在更慢的解離速率上°Biacore系統(tǒng)能 夠通過(guò)對(duì)評(píng)估抗體亞型和結(jié)合穩(wěn)定性來(lái)監(jiān)控ADA的成熟 過(guò)程。陽(yáng)性臨床樣品中的ADA集群可以通過(guò)ADA與固定 于芯片的藥物之間的結(jié)合穩(wěn)定性來(lái)表征（圖10）。


圖10.Biacore表征陽(yáng)性臨床樣品中ADA與到固定于芯片上的藥物的結(jié)合 穩(wěn)定性。免疫應(yīng)答成熟通常帶來(lái)更慢的解離速率（下圖）。
 

評(píng)估ADA的親和度或解離速率通常較難，因?yàn)椋鄶?shù)抗 體是二價(jià)的和異源的°Biacore T200軟件提供了專(zhuān)用工 具,可用來(lái)區(qū)分快速解離和緩慢解離的抗體組分造成的 免疫響應(yīng)。
 

Mytych等介紹了另外一種用于評(píng)估臨床樣品中ADA的解 離速率的方法，通過(guò)記錄ADA幵始解離前和解離40分鐘 后的響應(yīng)信號(hào)來(lái)計(jì)算信號(hào)損失百分比。6個(gè)臨床樣品的 結(jié)合信號(hào)在幵始解離40分鐘后降低大約68%和89%,而

高親和度的陽(yáng)性對(duì)照則幾乎沒(méi)有解離。

無(wú)需標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合檢測(cè)法

作為ADA表征的一部分，確認(rèn)為陽(yáng)性的樣品需要進(jìn)一步 檢測(cè)中和抗體（Nab）的存在°NAb對(duì)治療性生物藥物 有中和作用。常規(guī)的Nab檢測(cè)法是基于細(xì)胞的方法，而 這些檢測(cè)法通常很繁瑣，且重復(fù)性差。作為一種替代方 法，競(jìng)爭(zhēng)性配基結(jié)合（Competitive Ligand Binding, CLB） 檢測(cè)法會(huì)在有些時(shí)』候被研究者所使用。根據(jù)EMA指南草案, 對(duì)于單克隆抗體藥物，CLB檢測(cè)法通常作為首選方法, 而不是生物檢測(cè)法（11）。來(lái)自四個(gè)公司的案例研究已 經(jīng)證明，生物檢測(cè)法和CLB檢測(cè)法提供結(jié)果可比的NAb的 檢測(cè)（12）"LISA或ECL等需要標(biāo)記的檢測(cè)方法很可能 對(duì)NAb的檢測(cè)產(chǎn)生不利的影響。Biacore系統(tǒng)上進(jìn)行的CLB 檢測(cè)法不需要標(biāo)記，并可以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化。Biacore CLB檢測(cè)法的原理如圖11所示。

圖11具有藥物中和效果的ADA在CLB檢測(cè)法中被檢測(cè)。

檢測(cè)（診斷）試劑的可靠鑒定和驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和全面表征的試劑是保證任何檢測(cè)方法的有效 性的先決條件-Biacore系統(tǒng)提供關(guān)于檢測(cè)/診斷試劑性 質(zhì)相關(guān)的詳細(xì)信息，例如抗體-抗原結(jié)合的特異性、動(dòng)力 學(xué)和親和度，這對(duì)于在方法幵發(fā)過(guò)程中選擇最優(yōu)的試劑 十分重要。對(duì)于某些需要二級(jí)檢測(cè)試劑的方法（如二抗 等），鑒定多種檢測(cè)試劑彼此之間同時(shí)且獨(dú)立地結(jié)合于 各自抗原至關(guān)重要。這種鑒定可以在Biacore系統(tǒng)上很容 易實(shí)現(xiàn)，通過(guò)使用成對(duì)的抗原表位作圖功能自動(dòng)的完成。 除此之外，Biacore方法還能獲得的的動(dòng)力學(xué)和親和度信 息，可以幫助研究者優(yōu)化檢測(cè)方法的性能，且不會(huì)增加 對(duì)成本和其他資源的消耗。這些應(yīng)用的例子包括Merck Seron。公司，該公司的研究人員使用Biacore系統(tǒng)甄選最 優(yōu)的抗體用于磷酸激酶的檢測(cè)，也用于分析抗體的生物 素化修飾可能對(duì)橋聯(lián)免疫檢測(cè)方法的潛在影響。

致謝

有關(guān)方法比較、酸解離方法和驗(yàn)證的數(shù)據(jù)由德國(guó)默克雪 蘭諾（Merck Serono）公司的Kramer博士友情提供；免 疫原性相關(guān)的篩選數(shù)據(jù)由勃林格殷格（Boehringer Ingelheim） 公司友情提供。

技術(shù)概述

利用Biacore系統(tǒng)的 結(jié)合強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)

Biacore系統(tǒng)使用表面等離子共振（SPR）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子 相互作用。無(wú)需標(biāo)記，Biacore檢測(cè)法提供關(guān)于分子相互 作用的親和度、動(dòng)力學(xué)和特異性的信息。生物分子的活 性濃度也可以被測(cè)定。相互作用分子中的一個(gè)被固定于 傳感芯片表面上，而其他分子以液體形式流經(jīng)傳感器表 面。

兩者之間的任何相互作用通過(guò)靠近傳感器表面的質(zhì)量濃 度的變化（折光率變化）而被實(shí)時(shí)檢測(cè)，結(jié)合數(shù)據(jù)顯示 在傳感圖中，并對(duì)時(shí)間作圖，響應(yīng)信號(hào)用RU表示。

復(fù)合物在相互作用過(guò)程中的形成和解離進(jìn)程可以被實(shí)時(shí) 觀測(cè)，通過(guò)結(jié)合曲線的形狀可獲得的結(jié)合動(dòng)力學(xué)信息 （ka ， kd ）。

可以在www.gelifesciences.com/biacore上找到更多信息

A) B)

r

f寸

圖8.雙特異性ADAs在橋聯(lián)ELISA檢測(cè)法中不能被檢測(cè)到°（A）在人抗 體之間自發(fā)和隨機(jī)地發(fā)生交換，造成其中一些具有雙特異性。（B） 雙特異性IgG4在橋接ELISA中將不會(huì)被檢測(cè)，因?yàn)樗鼈儽仨氂袃煞N藥物 分子與一個(gè)ADA的結(jié)合。

抗原表位特異性的測(cè)定

在研究免疫原性時(shí)，ADAs的抗原表位特異性的測(cè)定十分 重要。根據(jù)FDA的建議（1）,申請(qǐng)人應(yīng)該研究在抗原上 的哪些區(qū)域產(chǎn)生了免疫應(yīng)答：“FDA建議申請(qǐng)人直接針 對(duì)完整分子和內(nèi)源對(duì)應(yīng)物進(jìn)行初步篩選試驗(yàn)。然而，對(duì) 于產(chǎn)品幵發(fā)，申請(qǐng)人應(yīng)該研究導(dǎo)致免疫響應(yīng)產(chǎn)生的特異 抗原區(qū)域或“抗原表位”。這種測(cè)定方法對(duì)于融合分子 可能尤為重要，因?yàn)閮蓚€(gè)蛋白是通過(guò)基因或物理手段被 “融合”在一起的?？梢栽诤Y選階段就利用Biacore系統(tǒng) 進(jìn)行抗原表位特異性的測(cè)定。一個(gè)便捷的方法就是固定 全長(zhǎng)的藥物在一個(gè)流動(dòng)池（Flow cell）中，同時(shí)固定藥 物的不同結(jié)構(gòu)域在其他流動(dòng)池中（圖9）。

Stubenrauch等人幵展的工作證明，可以通過(guò)很少量的 Biacore實(shí)驗(yàn)中獲取豐富的信息（10）。通過(guò)高效地利用 這四個(gè)流動(dòng)池，可以對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行整合11種指標(biāo)的完 整的的免疫原性檢測(cè)，包括臨床樣品中ADAs的應(yīng)答、亞 型、特異性和結(jié)合穩(wěn)定性等信息（圖9）。這種方法可將 來(lái)自藥物的特異性應(yīng)答與其他應(yīng)答區(qū)分幵來(lái)，例如抗Fc 片段的IgM類(lèi)風(fēng)濕性因子應(yīng)答。研究者可以跟蹤特定的 ADA形成的時(shí)間進(jìn)程，可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)每個(gè)病人的ADA應(yīng) 答分析，并與臨床觀察相關(guān)聯(lián)。評(píng)估ADA結(jié)合穩(wěn)定性一 般來(lái)說(shuō)，在生物分子相互作用實(shí)驗(yàn)中，解離速率是一種 可以估計(jì)結(jié)合親和度的指標(biāo)，抗體朝著更高親和度方向 上成熟通常會(huì)反映在更慢的解離速率上°Biacore系統(tǒng)能 夠通過(guò)對(duì)評(píng)估抗體亞型和結(jié)合穩(wěn)定性來(lái)監(jiān)控ADA的成熟 過(guò)程。陽(yáng)性臨床樣品中的ADA集群可以通過(guò)ADA與固定 于芯片的藥物之間的結(jié)合穩(wěn)定性來(lái)表征（圖10）。

時(shí)間（s）

1000-

大分子應(yīng)用專(zhuān)題

抗-IgM

第二次進(jìn)樣: 抗亞型抗體

第一次進(jìn)樣： 帶有ADA的樣品

2 全長(zhǎng)治 療藥物

抗-IgG (LC)抗-IgG (Fc) 抗-IgE

3

治療性藥物 的Fab片段

4

治療性藥物 的Fc片段

流動(dòng)池 1

(n叱)田=B1(n叱)田=

700

400

100

緩慢解離

（穩(wěn)定的相互作用）

圖9.同時(shí)進(jìn)行抗原表位作圖和亞型分析的檢測(cè)方法。

交叉反應(yīng)也可以采用相同的模式進(jìn)行測(cè)定，但是在每個(gè) 流動(dòng)池中固定不同的藥物。為了評(píng)估抗darbepoetin alfa 抗體是否存在潛在的對(duì)epoetin alfa的交叉反應(yīng)，Mytych 等幵發(fā)了一種基于Biacore的雙流動(dòng)池生物傳感器免疫檢 測(cè)法，其中含有一個(gè)固定有epoetin alfa通道（3）。這 種免疫檢測(cè)法被Amgen公司作為首選方法，用于檢測(cè)和 表征人血清中的抗epoetinalfa和抗darbepoetin alfa抗體。

-200 ——

150

250

350

450

550

圖10.Biacore表征陽(yáng)性臨床樣品中ADA與到固定于芯片上的藥物的結(jié)合 穩(wěn)定性。免疫應(yīng)答成熟通常帶來(lái)更慢的解離速率（下圖）。

評(píng)估ADA的親和度或解離速率通常較難，因?yàn)?，多?shù)抗 體是二價(jià)的和異源的°Biacore T200軟件提供了專(zhuān)用工 具,可用來(lái)區(qū)分快速解離和緩慢解離的抗體組分造成的 免疫響應(yīng)。

Mytych等介紹了另外一種用于評(píng)估臨床樣品中ADA的解 離速率的方法，通過(guò)記錄ADA幵始解離前和解離40分鐘 后的響應(yīng)信號(hào)來(lái)計(jì)算信號(hào)損失百分比。6個(gè)臨床樣品的 結(jié)合信號(hào)在幵始解離40分鐘后降低大約68%和89%,而

高親和度的陽(yáng)性對(duì)照則幾乎沒(méi)有解離。

無(wú)需標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合檢測(cè)法

作為ADA表征的一部分，確認(rèn)為陽(yáng)性的樣品需要進(jìn)一步 檢測(cè)中和抗體（Nab）的存在°NAb對(duì)治療性生物藥物 有中和作用。常規(guī)的Nab檢測(cè)法是基于細(xì)胞的方法，而 這些檢測(cè)法通常很繁瑣，且重復(fù)性差。作為一種替代方 法，競(jìng)爭(zhēng)性配基結(jié)合（Competitive Ligand Binding, CLB） 檢測(cè)法會(huì)在有些時(shí)』候被研究者所使用。根據(jù)EMA指南草案, 對(duì)于單克隆抗體藥物，CLB檢測(cè)法通常作為首選方法, 而不是生物檢測(cè)法（11）。來(lái)自四個(gè)公司的案例研究已 經(jīng)證明，生物檢測(cè)法和CLB檢測(cè)法提供結(jié)果可比的NAb的 檢測(cè)（12）"LISA或ECL等需要標(biāo)記的檢測(cè)方法很可能 對(duì)NAb的檢測(cè)產(chǎn)生不利的影響。Biacore系統(tǒng)上進(jìn)行的CLB 檢測(cè)法不需要標(biāo)記，并可以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化。Biacore CLB檢測(cè)法的原理如圖11所示。

致謝

有關(guān)方法比較、酸解離方法和驗(yàn)證的數(shù)據(jù)由德國(guó)默克雪 蘭諾（Merck Serono）公司的Kramer博士友情提供；免 疫原性相關(guān)的篩選數(shù)據(jù)由勃林格殷格（Boehringer Ingelheim） 公司友情提供。

技術(shù)概述

利用Biacore系統(tǒng)的 結(jié)合強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)

+ 拮抗藥 物，例 I 如可溶

中和性抗 藥抗體

受體： 固定的 傳感器芯片

￥

■ 性受體

SM)國(guó)國(guó)

AM)曰國(guó)

Biacore系統(tǒng)使用表面等離子共振（SPR）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子 相互作用。無(wú)需標(biāo)記，Biacore檢測(cè)法提供關(guān)于分子相互 作用的親和度、動(dòng)力學(xué)和特異性的信息。生物分子的活 性濃度也可以被測(cè)定。相互作用分子中的一個(gè)被固定于 傳感芯片表面上，而其他分子以液體形式流經(jīng)傳感器表 面。

兩者之間的任何相互作用通過(guò)靠近傳感器表面的質(zhì)量濃 度的變化（折光率變化）而被實(shí)時(shí)檢測(cè)，結(jié)合數(shù)據(jù)顯示 在傳感圖中，并對(duì)時(shí)間作圖，響應(yīng)信號(hào)用RU表示。

復(fù)合物在相互作用過(guò)程中的形成和解離進(jìn)程可以被實(shí)時(shí) 觀測(cè)，通過(guò)結(jié)合曲線的形狀可獲得的結(jié)合動(dòng)力學(xué)信息 （ka ， kd ）。

可以在www.gelifesciences.com/biacore上找到更多信息

時(shí)間（S） 時(shí)間（S） 時(shí)間（S）

圖11具有藥物中和效果的ADA在CLB檢測(cè)法中被檢測(cè)。

檢測(cè)（診斷）試劑的可靠鑒定和驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和全面表征的試劑是保證任何檢測(cè)方法的有效 性的先決條件-Biacore系統(tǒng)提供關(guān)于檢測(cè)/診斷試劑性 質(zhì)相關(guān)的詳細(xì)信息，例如抗體-抗原結(jié)合的特異性、動(dòng)力 學(xué)和親和度，這對(duì)于在方法幵發(fā)過(guò)程中選擇最優(yōu)的試劑 十分重要。對(duì)于某些需要二級(jí)檢測(cè)試劑的方法（如二抗 等），鑒定多種檢測(cè)試劑彼此之間同時(shí)且獨(dú)立地結(jié)合于 各自抗原至關(guān)重要。這種鑒定可以在Biacore系統(tǒng)上很容 易實(shí)現(xiàn)，通過(guò)使用成對(duì)的抗原表位作圖功能自動(dòng)的完成。 除此之外，Biacore方法還能獲得的的動(dòng)力學(xué)和親和度信 息，可以幫助研究者優(yōu)化檢測(cè)方法的性能，且不會(huì)增加 對(duì)成本和其他資源的消耗。這些應(yīng)用的例子包括Merck Seron。公司，該公司的研究人員使用Biacore系統(tǒng)甄選最 優(yōu)的抗體用于磷酸激酶的檢測(cè)，也用于分析抗體的生物 素化修飾可能對(duì)橋聯(lián)免疫檢測(cè)方法的潛在影響。