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哺乳動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)

       隨著細(xì)胞基因工程的不斷發(fā)展，目前有多種生物表達(dá)系統(tǒng)都能夠大規(guī)模的生產(chǎn)重組蛋白，主要分為原核和真核兩類。      真核表達(dá)系統(tǒng)又包括：酵母表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。相比之下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠促進(jìn)蛋白的正確折疊和糖基化等翻譯后修飾，從而保證蛋白的天然活性，目前已成為表達(dá)和生產(chǎn)部分蛋白藥物、基因工程抗體等目的蛋白的首選宿主。
       哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)常用的細(xì)胞有 HEK293（人胚腎細(xì)胞）和 CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）。這兩種細(xì)胞的應(yīng)用最為廣泛，是在真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)中最常用的細(xì)胞，具有以下特點(diǎn)：
1.具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)蛋白在任何方面都最接近天然狀態(tài)；
2.具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力，外源蛋白整合穩(wěn)定；
3.具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，表達(dá)水平較高；
4.CHO 屬于成纖維細(xì)胞，是一種非分泌細(xì)胞，自身很少分泌內(nèi)源蛋白，有利于目的蛋白的分離純化；
5.HEK293 細(xì)胞具有更高的生長(zhǎng)密度更快的生長(zhǎng)速度，易培養(yǎng)，易轉(zhuǎn)染。
本文主要對(duì) HEK293 細(xì)胞及 CHO 細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基本原則、實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)進(jìn)行介紹。

細(xì)胞培養(yǎng)基本原則

合適的細(xì)胞培養(yǎng)基
合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞傳代培養(yǎng)最重要的條件，培養(yǎng)基不僅提供給細(xì)胞在體外生長(zhǎng)繁殖需要的基礎(chǔ)物質(zhì)，還維持      細(xì)胞生長(zhǎng)的整個(gè)環(huán)境，不同的細(xì)胞有不同的生長(zhǎng)習(xí)性，因此要選擇合適的培養(yǎng)基。

優(yōu)質(zhì)血清
目前，多數(shù)的合成細(xì)胞培養(yǎng)基都有添加血清，常用的血清有小牛血清、馬血清等。血清中含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的生      長(zhǎng)因子，作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的附加物，血清十分昂貴且存在多種問(wèn)題，因此人們?cè)诓粩鄬ふ铱梢蕴娲宓奈?     質(zhì)。

無(wú)毒無(wú)菌的生長(zhǎng)環(huán)境
體外生長(zhǎng)的細(xì)胞缺乏對(duì)微生物和有毒物質(zhì)的抵御能力，一旦被污染，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)，      無(wú)毒無(wú)菌的培養(yǎng)環(huán)境是必要條件。

溫度與氣體環(huán)境
細(xì)胞生長(zhǎng)需要恒定的溫度，同時(shí)氣體（氧氣與二氧化碳）也是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的所必須的物質(zhì)，HEK293 和 CHO 的細(xì)胞培養(yǎng)條件一般是 37℃，5%的二氧化碳環(huán)境。

細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)流程

細(xì)胞復(fù)蘇

1.提前將水浴鍋打開，預(yù)熱 37℃。
2.細(xì)胞培養(yǎng)基提前預(yù)熱，5-10ml 于 15ml 離心管中。
3.把凍存細(xì)胞立即投入 37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng)，待融化后（大概 1-1.5min），取出。
4.用 75%乙醇消毒管外壁，放入超凈臺(tái),轉(zhuǎn)移到含 5-10ml 培養(yǎng)基的 15ml 離心管中，離心 800-1000rpm，5min。
5.去掉上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞分散均勻。
6.標(biāo)記好細(xì)胞名稱，代數(shù)，日期，培養(yǎng)基等，放到 37℃的 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7.貼壁細(xì)胞培養(yǎng)一般第二天就可以貼壁，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度，2-3 天換一次培養(yǎng)基。
8.離心可能對(duì)某些細(xì)胞造成傷害，這些細(xì)胞可以不離心，只需要將 DMSO 的濃度降到 1%以下即可。（一般凍存液中 DMSO 濃度為 10%，即 1ml 凍存細(xì)胞需加 9ml 培養(yǎng)基。）

細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1.當(dāng)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到 80%-90%時(shí)需要進(jìn)行細(xì)胞傳代。
2.吸掉培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)液。
3.用 5ml PBS 洗滌細(xì)胞 1-2 次。
4.用 1ml 的 trypsin（胰酶）溶液，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞呈圓形即將分離時(shí)，吸掉 trypsin 溶液。（若不去掉 trypsin 溶液，則在消化后加入適量（5:1）含血清培養(yǎng)基終止作用，離心后再去掉上清。）

5.輕拍培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶使細(xì)胞從瓶壁脫落，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，輕柔地吹打數(shù)次，使細(xì)胞分散均勻。再根據(jù)稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，正常培養(yǎng)即可，剩余細(xì)胞懸液舍棄，放入收集瓶中。（細(xì)胞傳代時(shí)按 1：5 或更大比例稀釋）
6.trypsin 溶液中可以加入 0.02% EDTA 溶液，解離效果會(huì)更好，但消化后殘留在培養(yǎng)基中的 EDTA 會(huì)影響細(xì)胞的再次貼壁。

細(xì)胞凍存
1. 冷凍前確保細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，傳代后的 5mL 細(xì)胞懸液取出 1mL 接種到培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代。另取一無(wú)菌離心管，將剩余 4mL 細(xì)胞懸液置于其中，離心 1000rpm，5min（轉(zhuǎn)速勿超過(guò) 1500rpm）。
2. 離心后倒掉上層清液，收集下層細(xì)胞沉淀。向離心管中加入 900ul 完全培養(yǎng)基，用槍頭反復(fù)吹打重懸起細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。一般細(xì)胞濃度為 2~5×106cells/mL 較適宜。
3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入 1.5mL 無(wú)菌凍存管中，再加入 100ul 試劑級(jí) DMSO，混勻，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSO 最后濃度為 10％）。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期，然后進(jìn)行凍存。
4. 傳統(tǒng)方法：冷存管置于 4℃ 10 分鐘→-20℃ 30 分鐘→-80℃ 16~18 小時(shí)（隔夜）→液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存（-20℃
勿超過(guò) 1 小時(shí)，防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大造成細(xì)胞死亡）。

細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

• 細(xì)胞培養(yǎng)大瓶好于小瓶，細(xì)胞能夠充分汲取到養(yǎng)分且有利于細(xì)胞均勻分布

• 細(xì)胞培養(yǎng)基 DEME 為高糖培養(yǎng)基

• 保證細(xì)胞培養(yǎng)液新鮮，采用少量多次配置，或培養(yǎng)基保存于-20℃

• 控制胰蛋白酶消化時(shí)間，消化時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞貼壁效果差

• 控制好細(xì)胞傳代時(shí)間，細(xì)胞沒(méi)有完全鋪滿、細(xì)胞之間留有空隙時(shí)傳代最佳

• 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則是慢凍快復(fù)，最大程度的保證細(xì)胞復(fù)蘇成功率

研錦生物具有豐富的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，熟悉各類細(xì)胞的培養(yǎng)方法：
 

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)原理的異同

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染都是將目的基因轉(zhuǎn)染至特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而表達(dá)得到目的蛋白。不同的是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式外源基因并沒(méi)有轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的染色體上而是存在于游離的載體上，這樣可以在短時(shí)間內(nèi)獲得基因的表達(dá)產(chǎn)物，但是隨著細(xì)胞的不斷分裂增殖外源基因最終會(huì)丟失，無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行重組蛋白的生產(chǎn)；而利用細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則會(huì)將外源基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞染色體上，目的基因不會(huì)隨著細(xì)胞傳代而消失，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的生產(chǎn)目的蛋白。

圖 1：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染原理對(duì)比

實(shí)驗(yàn)操作的差別

1.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所用的質(zhì)粒是不同的，瞬轉(zhuǎn)的質(zhì)粒不需要帶有抗性，而用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定要帶有特定的抗性以便于后續(xù)的克隆株篩選。另外，兩者所用的培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)試劑也有所區(qū)別。

2.構(gòu)建好質(zhì)粒后，經(jīng)過(guò)細(xì)胞復(fù)蘇、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白純化等步驟即可得到目的蛋白；而構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系需要先將構(gòu)建好的質(zhì)粒線性化，再導(dǎo)入培養(yǎng)好的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)一定的轉(zhuǎn)染方式實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒與細(xì)胞的融合，接著經(jīng)過(guò)細(xì)胞池篩選、單克隆篩選、細(xì)胞傳代培養(yǎng)等步驟才能得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的生產(chǎn)目的蛋白。

圖 2：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)流程                                          圖 3：細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)流程

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比