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酵母蛋白表達(dá)步驟/實(shí)驗(yàn)流程

       本文主要講述了酵母蛋白表達(dá)步驟，詳細(xì)酵母表達(dá)流程。從感受態(tài)細(xì)胞制備，轉(zhuǎn)化方法選擇及操作，從化學(xué)試劑PEG1000 轉(zhuǎn)化，電擊轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化三個(gè)方法入手及轉(zhuǎn)化子的篩選及最終的蛋白表達(dá)，全套酵母蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

質(zhì)粒線性化
在酵母表達(dá)系統(tǒng)中已經(jīng)介紹了酵母蛋白表達(dá)原理，因此線性化是酵母轉(zhuǎn)化的第一步，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

轉(zhuǎn)化方法

畢赤酵母PEG1000 轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備
配置緩沖液
1）緩沖液 A：1.0M 山梨醇，10mM 甘氨酸，pH8.35，3%（v/v）乙二醇，濾膜過濾，-20℃保存；
2）緩沖液 B：40%（w/v）PEG1000，0.2M 甘氨酸，pH8.35，濾膜過濾，-20℃保存；
3）緩沖液 C：0.15M NaCl，10mM 甘氨酸，pH8.35，濾膜過濾，-20℃保存；
4）未污染的新鮮、試劑級(jí) DMSO，-70℃保存
將 DNA 直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處（即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源 DNA 的能力也在解凍過程中迅速下降；樣品的轉(zhuǎn)化，進(jìn)行多組試驗(yàn)。

感受態(tài)制備
1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板（YPD：蛋白表達(dá)試劑配置），30℃培養(yǎng) 2 天；

2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩過夜；
3）過夜培養(yǎng)后按 1%左右的接種量接種到 100mlYPD 培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至 OD 值從 0.1 至 0.5~0.8；
4）3000~5000rpm 離心收集沉淀菌體，用 50ml 預(yù)冷 A 液洗滌，并重懸與 4mlA 液中；
5）根據(jù)每次使用量（0.1-0.2ml 左右）分裝與 1.5ml 離心管中，每管加入 10ul 的預(yù)冷 DMSO，混合后迅速-80℃
/液氮（感受態(tài)可以放到-80℃ ，但是酵母表達(dá)建議感受態(tài)現(xiàn)做現(xiàn)用）

酵母轉(zhuǎn)化
1）線性化質(zhì)粒 50ug（可預(yù)冷）溶于 200ul 的 TE 中，直接加入凍存的酵母感受態(tài)中；
2）37℃水浴 5min，過程混合樣品 2 次；
3）取出加入 1.5ml 緩沖液 B，徹底混勻；
4）30℃水浴 1 小時(shí)；
5）室溫 2000rpm 離心 10min，去上清，得沉淀，重懸菌體與 1.5ml 緩沖液 C 中；
6）再次離心，去上清，得沉淀，輕輕加入 0.2ml 緩沖液 C 重懸；
7）將重懸的轉(zhuǎn)化液涂與選擇性培養(yǎng)基（根據(jù)抗性配置）中，30℃孵育 3-4 天，進(jìn)行鑒定。
畢赤酵母電擊感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化

感受態(tài)制備
1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板，30℃培養(yǎng) 2 天；
2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩過夜；
3）過夜培養(yǎng)后按 1%左右的接種量接種到 100mlYPD 培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至 OD 值 1.2~1.5；
4）4℃，5000rpm 離心 5min 收集沉淀菌體，用 100ml 預(yù)冷無菌水重懸菌體；
5）4℃，5000rpm 離心 10min 收集沉淀菌體，用 100ml 預(yù)冷無菌水重懸菌體；
6）再次 4℃，5000rpm 離心 10min 收集沉淀菌體，用 100ml 預(yù)冷無菌水重懸菌體；
7）20ml，1mol/L 山梨醇洗滌 1 次；
8）將菌體溶于 200ul，1mol/L 預(yù)冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置幾小時(shí)，待轉(zhuǎn)化

酵母電轉(zhuǎn)
1）準(zhǔn)備好 80ul 的酵母感受態(tài)與線性化的質(zhì)粒 1-5ug（冰上預(yù)冷 15min）混合，迅速放入 0.2cm 的電擊杯中（電擊杯冰上預(yù)冷滅菌），電擊；
2）電擊結(jié)束，迅速加入 1ml 山梨醇，涂平板（在搖床上培養(yǎng) 1h 后涂平板也可）；
3）MD 培養(yǎng)基生長 3-4 天，ROB 培養(yǎng)基上生長 4-5 天后，鑒定。
?電擊注意點(diǎn)
1）線性化質(zhì)粒的含量在 1-5ug，純度越高越好，量要有保證，很多人找不到陽性轉(zhuǎn)化子可以考慮是否是這個(gè)因素造成；
2）感受態(tài)菌液收集，確定 OD 值在 1.2-1.5 之間，可以稀釋不同倍數(shù)，判斷是否是線性關(guān)系，菌液渾濁單 OD 值不高，可能是OD 稀釋倍數(shù)不夠；
3）感受態(tài)保存，感受態(tài)制備但其他還沒處理好，冰上放置的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率也會(huì)有影響，因此還是那個(gè)原則：現(xiàn)做現(xiàn)用；且分裝成每次夠用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染；                                      4）電擊杯清洗，先洗凈吹干，浸泡在 75%乙醇中，使用前超凈臺(tái)紫外滅菌，重復(fù)使用對(duì)實(shí)驗(yàn)也會(huì)有一定影響；
5）電擊參數(shù)，電壓及電擊時(shí)間可以摸索，適當(dāng)增加電壓或延長電擊時(shí)間，電擊過程冰上操作

畢赤酵母原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備

原生質(zhì)轉(zhuǎn)化原理
酵母細(xì)胞具有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁會(huì)組織其對(duì)外源 DNA 的攝入，因此，去除掉部分的細(xì)胞壁有利于酵母細(xì)胞對(duì) DNA 的吸收。利用藤黃節(jié)桿菌酶（為一種葡聚糖酶），可以部分消化細(xì)胞壁。關(guān)鍵在于不能過度的消化細(xì)胞壁，否則將造成細(xì)胞死亡。藤黃節(jié)桿菌酶的消化能力受到 SDS 的影響，可以加入 SDS 對(duì)其消化進(jìn)行控制，以得到消化適度的細(xì)胞。消化獲得 70%的原生質(zhì)細(xì)胞時(shí)，效果最好。

試劑配制
轉(zhuǎn)化當(dāng)天，配制如下溶液：
① SE：1M 山梨醇，25mM EDTA，pH8.0
② SCE：SE：1M 山梨醇，1mM EDTA，10mM 檸檬酸鈉緩沖液，pH8.5
③ SOS：1M 山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl2
④ CaS：1M 山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2
⑤ DTT，PEG：DTT 水配制為 1M 濃度，PEG 用水配制 40%（w/v）
⑥ CaT：20mM Tris pH7.5，20mM CaCl2
⑦ 藤黃節(jié)桿菌酶：用水配制成 3mg/ml 的濃度
⑧ 5%SDS 溶液，RD 融化瓊脂 100ml，1M 山梨醇每次轉(zhuǎn)化時(shí)配制
① SED：19ml LSE 加 1ml DTT
② PEG/Cat：1:1 混合 40%PEG 及Cat 其他試劑
① YPD 培養(yǎng)基 1L，YPD 平板 1L
② RDB 平板 1L，RDHB 平板 1L

感受態(tài)制備及消化細(xì)胞壁                              
 1）接種酵母受體菌單菌落于 YPD 平板，30℃培養(yǎng) 2 天；
2）挑取平板上的單菌落接種于 10mlYPD 液體培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩過夜；
3）取培養(yǎng)的細(xì)胞 5ul，10ul，20ul 分別加入到含有 200mlLYPD 的液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩過夜（300rpm）；
4）第二天測(cè)每個(gè)培養(yǎng)瓶中的 OD600 值，并取出事先配置好的轉(zhuǎn)化溶液，室溫放置：
5）收集 OD600 值在 0.2-0.3 對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，室溫離心（1500rpm5min 左右），得到沉淀；如果沒有培養(yǎng)瓶中的 OD 值在 0.3 左右的話，選擇一個(gè)培養(yǎng)瓶，用新配置的培養(yǎng)基以 1：4 稀釋，再次培養(yǎng)（2-3h 左右），直至出現(xiàn)OD 值為 0.2-0.3，收集細(xì)胞；
6）準(zhǔn)備去除細(xì)胞壁，準(zhǔn)備去壁試劑和待去壁的細(xì)胞；
7）準(zhǔn)備去壁試劑：現(xiàn)配 SED，保證DTT（分析級(jí)）的新鮮度，配完放-20℃；
8）準(zhǔn)備帶去壁細(xì)胞：先用滅菌水清洗，轉(zhuǎn)入離心管；1500rpm 離心 5min，收集細(xì)胞，用 20mlSED 重懸并洗滌離心；再次用 1M 山梨醇洗滌，離心（同上）；用SCE 重懸，分開至兩個(gè)離心管中（每管 10ml 左右）；
9）準(zhǔn)備藤黃節(jié)桿菌酶，取一管酶放置冰上，以上準(zhǔn)備的兩管細(xì)胞取出一管加入藤黃節(jié)桿菌酶，開始消化細(xì)胞（這一步可確定酶消化的最佳時(shí)間）；

最佳時(shí)間的確定

① 準(zhǔn)備 20ml 5%SDS 溶液分光光度計(jì)調(diào)至 800nm，空白對(duì)照為 800ul 5% SDS 及 200ul SCE；
② 準(zhǔn)備 10 個(gè)離心管，編號(hào)為 0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50（根據(jù)時(shí)間編號(hào)）；
③ 取上述 8 步中的另一管細(xì)胞，取出 200ul 加入至 0 號(hào)管中，放置冰上，此為 0 點(diǎn)；
④ 加入 7.5ul 藤黃節(jié)桿菌酶在剩余的細(xì)胞中，輕混，30℃孵育（不要晃動(dòng)）用來建立最佳時(shí)間所用
⑤ 2min 時(shí)取 200ul 懸浮液至 2 號(hào)管中，同理 4，5，6，7，8min 時(shí)重復(fù)操作，讀樣品 OD800 值；
⑥  用公式計(jì)算細(xì)胞去壁的效率：%去壁率=100-{（T  時(shí)間  OD800-0  時(shí)間  OD800  值）x100} 10）計(jì)算出去壁率為 70%左右時(shí)，得出最佳消化時(shí)間，同樣操作加入 7.5ul 消化酶于另一管中消化細(xì)胞
11）室溫離心去除懸浮液，1M 山梨醇洗滌一次，0.6mlCaS 懸浮細(xì)胞，立即轉(zhuǎn)化，去壁的細(xì)胞應(yīng)立即轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化畢赤酵母
1）取 100ul 將去壁細(xì)胞，放入 1.5ml 離心管中（滅菌）；
2）準(zhǔn)備 10ug 線性化質(zhì)粒（預(yù)冷）與去壁細(xì)胞混合，加入 1ml 新鮮 PEG/Cat 溶液，輕混，室溫孵育 10min；
3）室溫 750rpm 離心 10min，去除 PEG/Cat 溶液；并用 150ulSOS 培養(yǎng)基懸浮轉(zhuǎn)化細(xì)胞，室溫孵育 20min；
4）加入 800ul 1M 山梨醇，涂平板；
5）取 200ul 轉(zhuǎn)化細(xì)胞和 RD（液體）混勻倒于 RDB 平板上，凝固后導(dǎo)致平板，30℃培養(yǎng) 4-6 天，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子；
6）取 100ul 稀釋細(xì)胞，與 RDH（液體）混勻，涂在 RDHB 上，凝固后倒置生長，30℃培養(yǎng) 4-6 天，出現(xiàn)克隆， 表明去壁細(xì)胞可再次生長為分裂細(xì)胞。

陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與蛋白表達(dá)

Mut+和 Muts 表型的判斷
待轉(zhuǎn)化子在平板上生長一段時(shí)間后，進(jìn)行 Mut+和 Muts 的篩選。挑取單克隆，在 MM 及 MD 培養(yǎng)基上劃線或點(diǎn)（先在MM 平板上點(diǎn)，再在 MD 平板上點(diǎn)，一個(gè)克隆換一次牙簽），30℃培養(yǎng) 2 天。觀察，在MD 培養(yǎng)基上生長而在MM 培養(yǎng)基上不生長或長的很小即為 Muts 表型，其余為 Mut+表型。

Mut+的誘導(dǎo)表達(dá)
1）挑取單菌落，搖菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培養(yǎng)基中，30℃，300rpm 培養(yǎng)至 OD600 為 2-6（培養(yǎng)
15-18h 左右觀察）；
2）室溫 2000rpm 離心 5min，收集菌體，用上述培養(yǎng)基重懸，使 OD600 為 1.0 左右；將菌液至于 1L 搖瓶中，
30℃300rpm 培養(yǎng)，每 24 小時(shí)加入 100%甲醇，至終濃度為 0.5-1.0%；
3）根據(jù)時(shí)間點(diǎn)取樣（1ml）至于 1.5ml 離心管中，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達(dá)量和最佳收獲時(shí)間；
4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 進(jìn)行分析鑒定表達(dá)情況。

Muts 的誘導(dǎo)表達(dá)
1）挑取單菌落，搖菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培養(yǎng)基中，30℃，300rpm 培養(yǎng)至 OD600 為 2-6（培養(yǎng)
15-18h 左右觀察）；
2）室溫 2000rpm 離心 5min，收集菌體，用上述培養(yǎng)基重懸，使 OD600 為 1.0 左右；將菌液至于 1L 搖瓶中，
30℃300rpm 培養(yǎng)，每 24 小時(shí)加入 100%甲醇，至終濃度為 0.5-1.0%；
3）根據(jù)時(shí)間點(diǎn)取樣（1ml）至于 1.5ml 離心管中，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達(dá)量和最佳收獲時(shí)間；
4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 進(jìn)行分析鑒定表達(dá)情況。

酵母表達(dá)原理

      本文主要講述了畢赤酵母蛋白表達(dá)的原理，畢赤酵母表達(dá)能夠高效表達(dá)的機(jī)制。
      巴斯德畢赤酵母（以下簡稱畢赤酵母）能夠高效表達(dá)外源基因，是因?yàn)槠溆懈鼜?qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子，即醇氧化酶啟動(dòng)子PAOX。甲醇營養(yǎng)型酵母能將甲醇分解為甲醛和過氧化氫，在此反應(yīng)中參與的酶是醇氧化酶（AOX1 和 AOX2）。其中，AOX2 的表達(dá)量比 AOX1 低得多，以甲醇為唯一碳源時(shí)，AOX1 增至細(xì)胞總蛋白的 40%。PAOX1 受甲醇誘導(dǎo)和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1 的表達(dá)受到甲醇的嚴(yán)格控制。
      巴斯德畢赤酵母所表達(dá)的外源基因位于酵母染色體上，這是通過把攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒線性化，以同源重組的      方式整合到強(qiáng)啟動(dòng)子 PAOX1 的下游，目的基因一般插入到 5’AOX1 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間的單克隆位點(diǎn)。

畢赤酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)

1. 酵母表達(dá)宿主菌Mut+和 Muts
在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，乙醇氧化酶有兩種基因編碼，即 AOX1 和 AOX2。細(xì)胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力有 AOX1 提供，菌株利用甲醇的速度主要由 AOX1 基因表達(dá)的 AOX1 蛋白提供。當(dāng) AOX1 缺失，只存在 AOX2 時(shí)，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，這種細(xì)胞利用甲醇能力低，在甲醇培養(yǎng)基上生長緩慢的菌株表現(xiàn)型為 Muts。存在 AOX1， 細(xì)胞利用甲醇正常生長，在甲醇培養(yǎng)基上生長較快，這種菌株表現(xiàn)型為 Mut+，這就是甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)兩種 Muts 和 Mut+產(chǎn)生的原理。
?酵母表達(dá)系統(tǒng)常用宿主菌
GS115、KM71、SMD1168 是常用的表達(dá)宿主菌，均為甲醇誘導(dǎo)型。他們都是組氨酸缺陷型，如果表達(dá)載體上帶有組氨酸基因，可以補(bǔ)償宿主菌的組氨酸缺陷，所以可以在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選重組轉(zhuǎn)化子。在以葡萄糖或者甘油等為碳源的培養(yǎng)基上生長時(shí)，AOX1 基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)，宿主菌的 AOX1 基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，使目的基因大量表達(dá)。
?有無甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的 Mut+和 Muts 表現(xiàn)型
畢赤酵母的最適生長溫度為 28-30℃，誘導(dǎo)期間超過 32℃，不利于蛋白表達(dá)，并可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Muts 和 Mut+ 菌株在沒有甲醇存在的情況下生長速率一樣，存在甲醇的情況下，AOX1 啟動(dòng)子被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，Mut+較 Muts 生長更快（4-5 倍）。

1. 酵母蛋白表達(dá)載體
酵母蛋白表達(dá)載體的選擇
酵母表達(dá)產(chǎn)物有胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外表達(dá)兩種方式，這取決于表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建是否帶有信號(hào)肽，可根據(jù)基      因表達(dá)的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達(dá)載體。
① 胞內(nèi)表達(dá)載體：主要包括 pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2 等。該類載體將目的基因表達(dá)在胞內(nèi)，可避免酵母的糖基化，適合于通常在胞漿表達(dá)或不含-S-S-的非糖基化蛋白，較胞外分泌表達(dá)水平高但純化相對(duì)復(fù)雜。
② 分泌到胞外表達(dá)的載體：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P 等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，將外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號(hào)序列由 89 個(gè)氨基酸組成α交配因子的引導(dǎo)。
③ 多拷貝插入表達(dá)載體：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下，重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達(dá)量。

表達(dá)重組蛋白使其具體天然的 N 端
想實(shí)現(xiàn)表達(dá)重組蛋白使其具體天然的 N 端，將目的基因直接連接在 Kex2 蛋白酶切位點(diǎn)之后。Kex2 蛋白酶切位點(diǎn)在信號(hào)肽序列中谷氨酸和精氨酸連接處：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置為 Kex2 蛋白酶的酶切位點(diǎn)

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)機(jī)制/原理
畢赤酵母能夠高效的表達(dá)外源基因，是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)啟動(dòng)子乙醇氧化酶啟動(dòng)子（AOX1 和 AOX2）。AOX1 和 AOX2 及其產(chǎn)生的 Muts 和 Mut+表現(xiàn)型前文已經(jīng)敘述過。AOX1 受甲醇的誘導(dǎo)和葡糖糖或甘油的抑制。畢赤酵母表達(dá)的外源基因位于酵母染色體上，通過把構(gòu)建的質(zhì)粒/載體線性化（主要采用酶切），通過同源重組的方式整合到啟動(dòng)子 AOX 的下游，一般是插入到 5’AOX 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子信號(hào)之間的單克隆位點(diǎn)。